Padronização do Sperm Class Analyzer® (SCA®) para avaliação de espermatozoides equinos criopreservados / [Standardization of the Sperm Class Analyzer® (SCA®) for the evaluation of cryopreserved equine sperm]

Objetivou-se, no primeiro experimento, avaliar o efeito da velocidade de captura de imagens de 25Hz, 30Hz e 50Hz na cinética dos espermatozoides equinos criopreservados. Todas as velocidades mostraram-se adequadas para capturar o movimento espermático (P>0,05). No segundo experimento, objetivou-se avaliar o efeito da deposição de sêmen em lâmina sob lamínula, Leja®10 e 20, na cinética espermática. O uso de lâmina e lamínula foi superior às lejas para manter a LIN e o WOB (P<0,05). No terceiro experimento, objetivou-se avaliar o efeito das concentrações de 25, 50 e 100x106 na cinética espermática. As concentrações de 25 e 50 x106 foram superiores a 100x106 para preservar a LIN, a STR e a BCF e não afetar negativamente a motilidade (P<0,05). No quarto experimento, objetivou-se avaliar o efeito dos diluidores BotuCrio®, BotuSêmen®, TALP sperm e da solução fisiológica na cinética espermática. O BotuCrio® foi superior a todos os diluidores em preservar a BCF e os hiperativos (P<0,05). Conclui-se que o emprego da velocidade de captura entre 25 e 50Hz, a deposição do sêmen entre lâmina e lamínula e a rediluição em diluidor de congelação para atingir 25 a 50x106 de espermatozoides/mL são ideais para o SCA® avaliar, de forma fidedigna, o sêmen equino criopreservado.(AU)

The objective of the first experiment was to evaluate the effect of 25, 30 and 50Hz frame acquisition rate on equine cryopreserved sperm. All frame acquisition rates tested were adequate to capture the sperm movement (P>0.05). The aim of the second experiment was to evaluate the effect of chambers, slide-coverslip, Leja®10 and 20 on sperm movement. The use of slide-coverslip was superior to maintain LIN and WOB (P<0.05). The aim of the third experiment was to evaluate the effect of 25, 50 and 100x106 sperm/mL concentration on sperm movement. Concentrations of 25 and 50x106 sperm/mL were greater than 100x106 to preserve LIN, STR and BCF and did not adversely affect motility (P<0.05). The aim of the fourth experiment was to evaluate the effect of BotuCrio®, BotuSêmen®, TALP sperm and physiological solution on sperm movement. BotuCrio® was superior among other extenders in preserving BCF and hyperactive (P<0.05). It is concluded that the use of the frame acquisition rate between 25 and 50 Hz; the deposition of semen between slide and coverslip and new dilution in the freezing extender to 25-50x106 of sperm/mL is ideal to reliably evaluate cryopreserved equine semen by SCA®.(AU)

Influência de diferentes sistemas e curvas de congelamento na congelabilidade e fertilidade do sêmen equino / Influence of systems and freezing curve in equine semen freezability and fertility

Avaliou-se o efeito de curvas de congelação nos parâmetros espermáticos e na fertilidade, usando sêmen de alta e baixa congelabilidade. Experimento 1 - utilizou-se sêmen de quatro garanhões resistentes à congelação: grupo 1, palhetas refrigeradas até 5°C e congeladas com curva de -8°C/min; grupos 2 e 3, palhetas refrigeradas até 5°C (0,5°C/min.) e congeladas com curvas de -20°C/min e -10°C/min, respectivamente. Experimentos 2 e 3 - utilizaram-se cinco garanhões (Mangalarga Marchador), respectivamente, de alta e baixa congelabilidade: grupo 4, a mesma metodologia descrita no grupo 1; grupos 5 e 6, palhetas refrigeradas até 5°C (0,5°C/min) e congeladas com curva de -20°C/min, entre 5°C e -60°C, e -10°C/min, entre -60°C e -100ºC (grupo 5), e -25°C/min, de 5°C até -100°C (grupo 6). O sêmen foi avaliado após descongelamento pelo método computadorizado. No experimento 1, não houve diferença nos parâmetros avaliados. No experimento 2, os parâmetros motilidade total (MT) e motilidade progressiva foram superiores aos do grupo 6 em relação ao grupo 4. No experimento 3, a MT foi superior no grupo 6 em relação ao grupo 4. As curvas de congelação mais rápidas apresentaram melhores parâmetros de cinética espermática, após a descongelação, para o sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador.(AU)

The effect of freezing curves on sperm parameters and fertility, using resistant and sensitive semen to cryopreservation, was evaluated. In experiment 1, Semen from 4 stallions resistant to freezing was used: Group 1, straws were cooled to 5°C and frozen with a curve of - 8°C/min; Groups 2 and 3, straws were cooled to 5°C (0.5°C/min) and frozen with curves of - 20°C / min and - 10°C/min, respectively. In experiments 2 and 3, 5 stallions (Mangalarga Marchador) presenting respectively resistant and sensitive sperm to cryopreservation were used: Group 4, same methodology described for Group 1 was performed; Groups 5 and 6, straws were cooled to 5°C (0.5°C/min) and frozen with a curve of - 20°C/min. between 5°C and - 60°C and -10°C/min. between - 60°C and - 100°C (Group 5) and - 25°C/min. 5°C to - 100°C (Group 6). Thawed-semen was evaluated by the computerized method CASA. In Experiment 1, there was no difference in the evaluated parameters. In Experiment 2, total motility (MT) and progressive motility (PM) were higher in Group 6 compared to Group 4. In Experiment 3, TM was higher in Group 6 than Group 4. The faster freezing curves showed better parameters of sperm kinetics after thawing, for the Mangalarga Marchador stallion semen.(AU)

Cholesterol Loaded Cyclodextrin Increases cryopreservability of Marwari Stallion (Equus ferus caballus) Spermatozoa by Increasing Cholesterol to Phospholipid Ratio

The study was conducted to investigate the effects of different levels of cholesterol loaded cyclodextrin (CLC) addition on cooled and frozen-thawed spermatozoa of Marwari stallion. A total of 48 ejaculates were collected from six adult Marwari stallions (8 ejaculates from each stallion) aged between 4 to 7 years. Immediately after collection semen sample was macroscopically evaluated and filtered into a warm, graduated measuring bottle to get gel free semen. The level of cholesterol (C) and phospholipid (P) in fresh spermatozoa were measured using ELISA. The semen sample was divided in to five equal aliquots (T0, T1, T2, T3 and T4). Primary extender containing different concentrations of CLC was added to each aliquot (0, 1, 1.5, 2 and 3 mg/ml CLC in T0, T1, T2, T3 and T4, respectively). All the aliquots were incubated for 15 minutes at 37°C for incorporation of CLC in sperm plasma membrane and then cryopreserved. Level of C and P in spermatozoa was also evaluated at pre-freeze and post-thaw stages. The mean C, P and C: P ratio in fresh sperm was 15.36±0.47 μg/100 × 106 sperm cells, 46.21±1.27 μg/100 × 106 sperm cells and 0.33±0.071, respectively. The mean C content and C: P ratio were significantly higher (P<0.05) in group T3 as compared to other groups at both pre-freeze and post-thaw stages. It was concluded that addition of CLC may be helpful in increasing cryopservability of stallion spermatozoa

The effects of xanthan gum on equine sperm quality during cooling storage / Efeitos de xantam gum em qualidade de esperma equino durante armazenamento resfriado

This study was designed to evaluate the possible benefits of adding xanthan gum to a standard extender for equine through in vitro analyzes of sperm quality. Semen was collected four times from five different stallions (n= 20 samples) and subjected to cooled storage under different conditions: control (only standard extender) and three different concentrations of xanthan gum (0.01%, 0.12%, and 0.25%) supplemented to the extenders. Sperm parameters, such as motility, mitochondrial functionality, and membrane, acrosome, and DNA integrity were measured after 0h, 24h, 48h, and 72h of sperm storage at 5ºC. Our observations indicated that sperm motility declined with longer cooling period with the 0.25% xanthan gum supplementation group compared with the control group. Other parameters, such as mitochondrial functionality and membrane and acrosome integrity also declined for all treatments during storage; however, no differences were observed between xanthan gum and control groups. DNA integrity did not significantly change during the storage. In conclusion, the addition of xanthan gum to equine semen extender is not harmful to the sperm structure, despite reducing the sperm motility.(AU)

Esse estudo foi desenvolvido para avaliar os possíveis benefícios de acrescentar xanthan gum a um extensor padrão através de analises in vitro de qualidade de esperma. Semen foi coletado quatro vezes de cinco garanhões diferentes (n = 20 amostras) e submetido a armazenamen to resfriado em diferentes condições: controle (apenas extensor padrão) e três diferentes concentrações de xanthan gum (0,01%, 0,12% e 0,25%) suplementado aos extensores. Parâmetros dos espermatozoides, como mobilidade, funcionamento mitocondrial e integridade de membranas, acrossomos e DNA forma medidos após 0h, 24h, 48h e 72h de armazenamento a 5oC. Nossas observações indicaram que motilidade reduziu com armazenamento resfriado prolongado no grupo de 0,25% de suplementação de xanthan gum comparado ao grupo controle. Outros parâmetros, como funcionalidade mitocondrial e integridade de membrana e acrossomos também reduziu em todos os tratamentos durante o armazenamento, no entanto não foram detectadas diferenças significativas entre grupos tratados e grupo controle. Integridade de DNA não mudou significativamente durante armazenamento. Em conclusão, a adição de xanthan gum a extensor de sêmen equino não é danosa à estrutura do espermatozoide apesar de reduzir motilidade.(AU)

Cooling of ejaculated and epididymal stallion sperm / Refrigeração de espermatozoides do ejaculado e epidídimo em garanhões

After a serious injury or sudden death, epididymis cauda sperm recovery and cryopreservation may present as the last opportunity to obtain genetic material from a valuable stallion. This study evaluated the viability of cooled equine sperm collected by three different methods: sperm of ejaculated (G1), sperm recovered from the epididymal cauda immediately after orchiectomy (G2) and sperm recovered from the epididymal cauda after storage for 24 hours at 5°C (G3). To obtain G1 sperm, two ejaculates were collected. After 1 week, all stallions underwent a bilateral orchiectomy, and one of the removed epididymides was flushed to obtain G2 sperm. The contralateral epididymis was stored at 5°C for 24 hours before being flushed to obtain G3 sperm. The sperm samples were evaluated immediately after the addition of the refrigeration extender, and after 24 and 48 hours of storage at 5°C. After 24 and 48 hours of storage, the epididymal sperm demonstrated higher motility traits when compared to the ejaculated sperm (P<0.05). These results indicate that sperm recovered from the epididymal cauda of stallions are more resistant to the cooling process, with higher kinetic parameters and plasma membrane integrity when compared to the ejaculated sperm.

A recuperação de espermatozoides da cauda do epidídimo pode ser a última chance para preservação do germoplasma quando ocorre morte súbita ou lesão grave em garanhões de alto valor genético. O presente trabalho comparou a viabilidade após refrigeração dos espermatozoides do ejaculado (G1), recuperados da cauda do epidídimo imediatamente após a orquiectomia (G2) e recuperados após armazenamento do epidídimo por 24 horas a 5ºC (G3). No G1 foram colhidos dois ejaculados. Uma semana após a colheita dos ejaculados os garanhões foram submetidos à orquiectomia bilateral e realizada a colheita dos espermatozoides da cauda do epidídimo de um testículo de cada garanhão (G2). O testículo contralateral permaneceu a 5°C por 24 horas, antes da recuperação espermática (G3). A análise das amostras foi realizada imediatamente após a adição do meio de refrigeração, e após 24 e 48 horas de armazenamento a 5°C. Após 24 e 48 horas de armazenamento, os espermatozoides do epidídimo demonstraram características de cinética maiores que os do ejaculado (P<0.05). Estes resultados indicam que espermatozoides recuperados da cauda do epidídimo foram mais resistentes ao processo de refrigeração, com maiores parâmetros de cinética espermática e integridade da membrana plasmática quando comparados aos espermatozoides do ejaculado.

Reproducción Estacional en el Macho / Seasonal Reproduction in the Male

Hay una sorprendente relación entre el ambiente y adaptaciones de la conducta reproductiva, muy evidente en los reproductores estacionales que pueden reproducirse en días cortos o largos, de acuerdo a factores proximales, especialmente el fotoperiodo luminoso que provoca cambios fotoneuroendocrinos. Estos, involucran fotoreceptores, un reloj biológico y el aparato neuroendocrino. Las gonadotrofinas (GT), el desarrollo gonadal, la retroalimentación negativa de las GT por los esteroides sexuales, la intervención de las fibras retino-hipotalámico y los núcleos supraquiasmáticos así como la secreción de melatonina, intervienen en esta regulación. El pulso generador del hipotálamo (eminencia media) es importante en el control de la adenohipófisis respecto de la secreción de LH y FSH. En el testículo, las endocrinocitos intersticiales (de Leydig) (que secretan testosterona y también estrógenos), establecen un asa de retroalimentación con la adenohipófisis y el hipotálamo en un circuito de asa larga, corta y ultracorta, donde neuronas neuroendocrinas tienen un rol importante. Los sustentocitos (células de Sertoli) (intratubulares) son importantes por su rol mecánico, trófico y metabólico respecto a las células germinales y la secreción de activina e inhibina, que provoca o inhibe la secreción de FSH respectivamente. Los sustentocitos también secretan muchas proteínas específicas entre las cuales se encuentra la proteína que liga andrógenos (ABP), importante porque concentra 100 veces la testosterona en el parénquima testicular. La secreción tónica, por pulsos de GT, especialmente LH, es debida a actividad hipotalámica a través del control de generación de estos pulsos que se inicia en la pubertad. La reproducción en el potro y el toro se presentan como ejemplos.

There is a surprising interrelationship between environments and adaptation of reproductive behaviour, very evident in seasonal breeders; which may reproduce in long or short days, according to proximal factors, mainly the light photoperiod which triggers photoneuroendocrine changes. These involve photoreceptors, a clock and the neuroendocrine apparatus. Gonadotropins (GT), gonadal development, negative feed back of GT done by sexual steroid, the intervention of the retino-hypothalamic fibers, and suprachiasmatics nucleus as well as melatonine secretion, intervene in this regulation. Of importance is the pulse generator of the hypothalamus (medial eminence) and its control of adenohypofisis for the secretion of LH and FSH. In the testis interstitial endocrine cells (Leydig)(secreting testosterone and also estrogens), establish a feed back loop with the adenohypofisis and hypothalamus in a circuit of long, short and ultra short circuit with neuroendocrine neurons playing a key role. Sustentocyte intratubular (Sertoli)are also important for their trophic, mechanic and metabolic relationships with the germ cells, and the secretions of activine and inhibine, which triggers or inhibits FSH secretions respectively. Sustentocyte also secrete many specifics proteins among which ABP (Androgen Binding Protein) is important because it concentrates 100 fold testosterone in the testicular parenchyme. Tonic secretion by pulses of GT, mainly LH, is due to hypothalamic activity with the control generation of these pulses by puberty. Reproduction in the stallion and the bull are presented as examples.

Damage assessment of the equine sperm membranes by fluorimetric technique

To validate a practical technique of simultaneous evaluation of the plasma, acrosomal and mitochondrial membranes in equine spermatozoa three fluorescent probes (PI, FITC-PSA and MITO) were associated. Four ejaculates from three stallions (n=12) were diluted in TALP medium and split into 2 aliquots, 1 aliquot was flash frozen in liquid nitrogen to induce damage in cellular membranes. Three treatments were prepared with the following fixed ratios of fresh semen: flash frozen semen: 100:0 (T100), 50:50 (T50), and 0:100 (T0). A 150-µL aliquot of diluted semen of each treatment was added of 2 µL of PI, 2 µL of MITO and 80 µL of FITC-PSA; incubated at 38.5ºC/8 min, and sperm cells were evaluated by epifluorescent microscopy. Based in regression analysis, this could be an efficient and practical technique to assess damage in equine spermatozoa, as it was able to determine the sperm percentage more representative of the potential to fertilize the oocyte.

Para validar uma técnica prática de avaliação simultânea das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial em espermatozóides eqüinos três sondas fluorescentes (PI, FITC-PSA e MITO) foram associadas. Quatro ejaculados de três garanhões (n=12) foram diluídos em meio TALP e divididos em duas alíquotas, uma alíquota foi submetida a flash frozen em nitrogênio líquido para induzir danos nas membranas celulares. Três tratamentos foram preparados com as seguintes proporções de sêmen fresco: sêmen flash frozen: 100:0 (T100), 50:50 (T50), e 0:100 (T0). Uma amostra de 150 µL de sêmen diluído de cada tratamento foi adicionada de 2 µL de PI, 2 µL de MITO e 80 µL de FITC-PSA; incubadas à 38,5ºC/8 min, e as células espermáticas foram avaliadas por microscopia de epifluorescência. Baseados na análise de regressão esta é uma técnica eficiente e prática para determinar danos em espermatozóides eqüinos, capaz de determinar a porcentagem de espermatozóides mais representativa do potencial fertilizante do ovócito.

Equine coital exanthema in a stallion / Herpesvirus equino 3 em um garanhão

Em agosto de 2008, um garanhão da raça Mangalarga Marchador, de quatro anos de idade, com histórico clínico de apatia, inapetência e edema de prepúcio e escroto, apresentou, ao exame clínico, exsudato purulento fluindo pelo óstio prepucial, prepúcio e mucosa peniana com inúmeras lesões circulares de bordos elevados e hiperêmicos, centro ulcerado recoberto por material amarelado de aspecto fibrinoso, com distribuição multifocal. Histologicamente, a mucosa peniana apresentou áreas de ulceração associadas a infiltrado inflamatório misto, com necrose multifocal e moderado acúmulo de fibrina, que se estendiam para o tecido conjuntivo adjacente. O diagnóstico morfológico foi de balanopostite ulcerativa fibrino-necrótica multifocal intensa, similar ao encontrado em casos de exantema coital equino (ECE), causado pelo herpesvírus equino 3 (EHV-3). Amostra de pele do prepúcio e sangue, colhido em EDTA, foram submetidos a ensaios de PCR específicos para EHV-3, observando-se a amplificação de um produto de tamanho esperado de 518pb. A detecção do EHV-3 foi confirmada por meio de seu sequenciamento, sendo a sequência de nucleotídeos depositada no GenBank sob o número GQ336877. As sequências de nucleotídeos e as de aminoácidos deduzidos apresentaram identidade de 99 por cento e 100 por cento, respectivamente, com a sequência de EHV-3 disponível no GenBank, número AF081188. Após 15 dias de tratamento, houve completa cicatrização das lesões, com despigmentação da pele, principalmente, no prepúcio e na bolsa escrotal. Com base nos achados clínicos, histopatológicos, PCR e sequenciamento, concluiu-se tratar de um caso de exantema coital equino, sendo o primeiro com confirmação definitiva do agente etiológico no Brasil.

Anormalidades de acrossomo e fertilidade em um garanhão: relato de um caso / Acrossomal abnormalities and fertility in a stallion: a case report

Descrevem-se os aspectos qualitativos do sêmen e a fertilidade de um garanhão da raça PSI (Puro Sangue Inglês), durante cinco períodos reprodutivos (1990 a 1994). Verificaram-se altos índices de acrossomo anormais (13,6 a 39 por cento) nos ejaculados (N° = 15), na maioria do tipo "Knobbed AcrosomeDefect" (área hipercromática ou espessamento excêntrico apical dos espermatozóides afetados. A porcentagem de prenhez (P) variou entre 25 e 90 por cento e a porcentagem de prenhez por ciclo (P/C) entre 20 e 59 por cento. Através de análise de regressão, P/C relacionou-se significativamente (p<0,05) com os índices de acrossomos anormais (R²=0,87). As demais características seminais avaliadas, não se relacionaram aos índices de fertilidade. Conclui-se que o defeito de acrossomo, neste caso, podem ser atribuídas à espermiogênese imperfeita. Tal anormalidade afeta significativamente a fertilidade do garanhão.

It is described certain qualitative seminal characteristics and the fertility of a Thoroughbred stallion, during five consecutive breeding seasons (1990 a 1994). High percentages (13.6 a 39 percent) of abnormal acrossomes were observed in the ejaculates (N° = 15), being the majority of the "Knobbed Acrosome Defect" type (dark staining area or eccentric thickening at the apex of affected spermatozoa). The pregnancy rate (P) varied between 25 e 90 percent and the per cycle pregnancy (P/C) between 20 e 59 percent. Regression analysis showed that P/C was significantly (p<0.05) related to the percentage of abnormal acrossomes (R²=0.87). Other seminal characteristics considered in this report were not associated (P>0.05) to fertility indexes. The conclusion is that the acrossomal defect, in the present case, could be attributed to arrested spermiogenesis. Such abnormality significantly affected stallion fertility.

Fertilidade em garanhões avaliada através do exame andrológico / Fertility in stallions as accessed by the breeding soundness examination

O presente trabalho teve por objetivo discutir aspectos da fertilidade de garanhões e sua relação com o exame andrológico. Numa primeira análise, 10 garanhões usados em monta natural exclusivamente, tiveram seus índices reprodutivos relacionados a qualidade do seu sêmen. Num segundo grupo, foram considerados 14 garanhões cujos acasalamentos eram, alternadamente, inseminação artificial e/ou monta natural. No terceiro estudo, foram relacionados garanhões específicos, pertencentes aos dois grupos anteriores, sabidamente subférteis em que os índices de fertilidade foram relacionados a características do sêmen ou manejo. Quando os garanhões são submetidos a monta natural dentro de um programa de manejo racional existe uma significativa relação entre qualidade de sêmen e fertilidade (P <0,01). O mesmo não se verifica quando há interferência de manejo (homem), usando inseminação artificial e modificando condições naturais (inseminação artificial inadequadamente empregada reduzindo a fertilidade e. adequadamente empregada, melhorando a fertilidade de garanhões subférteis). A análise de exames andrológicos individuais evidencia falares intrínsecos e extrínsecos (manejo) afetando a fertilidade.

This paper discuss certain aspects of the fertility in stallions and its relationship to the Breeding Soundness Examination. In afirst analysis, 10 stallions that were bred only naturally had their reproductive standards correlated to the sêmen quality. In a second step, we consider 14 stallions that were bred either by artificial insemination and for naturally. In a third study, certain subfertile stallions, belonging to the previous two groups, had their fertility standards correlated to sêmen quality and management procedures. A significam association (P<0.01) was observed between sêmen quality (sperm morphology) and fertility, when stallions were bred naturally under appropriate management procedures. This relationship was not observed when artificial insemination was included in the management, because it can improve the fertility of subfertile stallions or be detrimental to normal stallions when misused used. The individual analysis of the subfertile stallions allowed to determine if the cause the infertility can befrom intrinsic or extrinsic (management) factors.